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生物樣品掃描電鏡

更新時間:2024-09-26

簡要描述:

生物樣品掃描電鏡常規(guī)掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的,不含水分或揮發(fā)性物質(zhì);具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊;具有導電性,被激發(fā)時能夠產(chǎn)生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多,質(zhì)地柔軟,機械強度小;組成元素的原子序數(shù)低,導電性差,激發(fā)后二次電子的產(chǎn)額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態(tài),又要改良其物理性能,使其適合在電鏡下觀察成像。

    生物樣品掃描電鏡簡稱為掃描電鏡,英文縮寫SEM(Scanning Electron Microscope)。它是用細聚焦的電子束轟擊樣品表面,通過電子與樣品相互作用產(chǎn)生的二次電子、背散射電子等對樣品表面或斷口形貌進行觀察和分析。SEM已廣泛應用于材料、冶金、礦物、生物學領(lǐng)域。

  通常人眼能夠分辨的最小距離為0.2MM,為了觀察分析更微小的細節(jié),人們發(fā)明了各種觀察儀器。

  首先出現(xiàn)的是光學顯微鏡,它利用可見光作為照明束照射樣品,再將照明束與樣品的作用結(jié)果由成像放大系統(tǒng)處理,構(gòu)成適合人眼觀察的放大像。一般而言光學顯微鏡能分辨的最小距離約為200um,是人眼的一千倍。

  為突破光學顯微鏡的分辨極限,人們想到用電子束做照明束,并與上個世紀三十年代制造出了第一臺掃描電子顯微鏡。它的分辨率已經(jīng)達到了原子水平(≈0.1um),比光學顯微鏡提高了近兩千倍。

  掃描電子顯微鏡組成部分

  電子光學系統(tǒng)

  組成:電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。

  作用:獲得掃描電子束、作為產(chǎn)生物理信號的激發(fā)源。

  信號收集和顯示系統(tǒng)

  信號收集:二次電子和背散射電子收集器、吸收電子顯示器、X射線檢測器(波譜儀和能譜儀)

  顯示系統(tǒng):顯示屏有兩個,一個用于觀察,一個用于記錄照相。

  掃描電子顯微鏡的應用

  掃描電鏡觀察納米材料

  所謂納米材料就是指組成材料的顆粒或微晶尺寸在0.1-100nm范圍內(nèi),掃描電鏡的一個重要特點就是具有很高的分辨率。現(xiàn)已廣泛用于觀察納米材料。

  掃描電鏡觀察材料斷口

  掃描電鏡所顯示的斷口形貌從深層次,高景深的角度呈現(xiàn)材料斷裂的本質(zhì),在教學、科研和生產(chǎn)中,有不可替代的作用,在材料斷裂原因的分析、事故原因的分析已經(jīng)工藝合理性的判定等方面是一個強有力的手段。

  掃描電鏡觀察大試樣的原始表面

  掃描電鏡能夠直接觀察直徑100mm,高50mm,或更大尺寸的試樣,對試樣的形狀沒有任何限制,粗糙表面也能觀察,這便免除了制備樣品的麻煩,而且能真實觀察試樣本身物質(zhì)成分不同的襯度(背反射電子象)。

      生物樣品掃描電鏡常規(guī)掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的,不含水分或揮發(fā)性物質(zhì);具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊;具有導電性,被激發(fā)時能夠產(chǎn)生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多,質(zhì)地柔軟,機械強度小;組成元素的原子序數(shù)低,導電性差,激發(fā)后二次電子的產(chǎn)額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態(tài),又要改良其物理性能,使其適合在電鏡下觀察成像。

       電鏡是進行材料表征時用到一種重要工具,幫助觀察材料的微觀形貌。然而,在觀察軟/濕生物材料時(離體組織,帶細胞材料等),涉及到觀察樣品的固定、脫水、干燥、金屬濺射等步驟,處理復雜,耗時較長。

冷凍的水凝膠觀察

生物樣品掃描電鏡的構(gòu)成:

  主要四大系統(tǒng):電子光學系統(tǒng)、信號收集及顯示系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和電源系統(tǒng)。
 ?。?) 電子光學體系:主要包括電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。
  電磁透鏡:聚焦電子槍束斑,束斑越小,成像單元越小,分辨率越高。
  掃描線圈:使電子束偏轉(zhuǎn),在樣品上做光柵狀掃描,激發(fā)多種電子信號。

  樣品室:放置樣品,并安裝有各種信號探測器。

  (2)信號收集及顯示系統(tǒng):收集樣品在入射電子束作用下產(chǎn)生的各種信號,二次電子、背散射電子、特征X射線等,并進行放大轉(zhuǎn)換顯示在顯示系統(tǒng)上像。

  (3)真空系統(tǒng):場發(fā)射電子顯微鏡的電子槍需要高真空度,所以配有2臺離子泵,1臺分子泵和一臺機械抽空泵。

  (4)電源系統(tǒng):包括啟動的各種電源,檢測-放大系統(tǒng),真空系統(tǒng)和成像系統(tǒng)等。

  分辨率的下降,掃描樣品在干燥過程中,由于失去水分會造成組織和細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生皺縮。此外,液體巨大的表面張力,將對細胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴重的影響。因此,生物樣品的干燥是掃描制備中的關(guān)鍵。樣品觀察表面必須具有良好的導電性和較高的二次電子發(fā)射率

        生物樣品掃描電鏡掃描圖像的質(zhì)量與樣品受激發(fā)產(chǎn)生的二次電子的多少有很大的關(guān)系。對于一幅由10°個像素組成的圖像,生物樣品掃描電鏡掃描探針在樣品的每個掃描點上要產(chǎn)生平均6個二次電子,對于生物樣品,一般只能產(chǎn)生0.1~2個二次電子,使得圖像的質(zhì)量與分辨率均受到影響。另一方面由于生物樣品的導電性較差,入射電子在樣品表面堆積,容易形成充放電現(xiàn)象,造成忽亮忽暗、全黑全白、圖像錯位等反常圖像。因此,提高樣品的導電性、消除充放電效應和增強二次電子發(fā)射率是生物樣品掃描制備的另一個基本要求。

 低真空下電鏡觀察葉子氣孔

  是在真空狀態(tài)下觀察樣品的表面形態(tài)。而生物樣品主要特點是含水量多,脫水干燥過程中容易收縮變形;大多數(shù)生物組織由碳、氫、氧、磷、鉀等原子序數(shù)較低的元素組成,不易激發(fā)二次電子,導電性較差。因此制備的樣品要求滿足以下條件。
  1.樣品觀察表面必須真實

  樣品觀察表面必須保持其在活休狀態(tài)時的形貌。在樣品處理中要去掉覆蓋在表面的灰塵、粘液、蠟質(zhì)等雜質(zhì)。此外,取樣時避免機械損傷。

  2.樣品必須干燥且不變形

  含水的生物樣品在真空條件下極易揮發(fā),因此,在掃描觀察時樣品必須干燥,以防水分的蒸發(fā)影響儀器的真空度

  注意事項:
  1.細菌和真菌的處理方法與細胞一樣,但固定時間需延長(幾小時甚至過夜);

       2.在樣品制備的過程中應始終保持樣品濕潤,切勿讓樣品干裂;

       3.由于掃描電鏡觀察樣品表面,因此一定要沖洗干凈樣品表面的殘余雜質(zhì);

       4.較大樣品需將樣品切成片狀,厚度不超過2-3mm。

  一、取樣:

  選取觀察材料需根據(jù)材料的特性與觀察目的的不同,采取不同的方法。取樣的基本要求:取材動作迅速;取材部位準確;固定及時;避免機械損傷。體積的大小沒有太大的限制,觀察表面的面積通常不超過10mm×10mm,厚度約兒個毫米。對于一些微小的單體材料(如游離細胞、細菌、線蟲等),取樣時應注意材料數(shù)量要取夠,防止在制備過程中由于丟失造成材料不足而影響觀察。對于樣品斷裂面的獲取最好采用冷凍斷裂的方法。

  二、清洗:
  樣品的清洗主要有二個作用。其一是用清洗液除去樣品觀察表面的雜質(zhì)或異物,其二是用緩沖液清洗掉沒有與樣品結(jié)合的固定劑。

  用清洗液清洗去除樣品表面的灰塵、粘液、油脂、蠟質(zhì)等,可使樣品表面充分暴露。清洗液有雙蒸水、生理鹽水、含酶的清洗液、各種緩沖液、有機溶劑等。清洗的方法可采用氣吹、沖洗、刷洗、超聲波清洗等方法。清洗過程中要避免對樣品表面細微結(jié)構(gòu)損傷。清洗的具體做法可根據(jù)研究l的、樣品性質(zhì)和樣品對環(huán)境變化的敏感程度選用不同的清洗液和清洗方法。

  三、固定
  固定的目的是利用固定劑保存樣品細胞內(nèi)的各種成分和結(jié)構(gòu),使它盡可能接近活體狀態(tài)。固定的方法的是戊二醛——餓酸雙固定,其中餓酸固定還具有增加組織的導電性的作用。對一些觀察倍數(shù)要求不是很高的材料,可只用戊二醛單固定。對一些形態(tài)結(jié)構(gòu)不易發(fā)生變化的材料(如種子、某些花粉、孢子等),甚至可以不用固定。固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌、菌絲之類的材料,可用餓酸蒸氣薰蒸加以固定。培養(yǎng)細菌的菌毛在取樣之前,可先加入戊二醛固定。

  固定劑的種類、配制方法、固定時間和操作條件及要求與透射電鏡樣品固定處理基木相同。

  四、脫水

  掃描電鏡樣品脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水,為了使樣品在干燥過程中,避免樣品中水分直接蒸發(fā)時產(chǎn)生巨大的表面張力(水的表面張力在20℃時達46000kg/cm3),使樣品結(jié)構(gòu)遭到損傷。常用的脫水劑是乙醇和丙酮,采用等梯度系列脫水的方法,脫水時間間隔5~15分鐘。在100%脫水劑中要過2~3次。

螨蟲自然風干電鏡直接觀察

選擇電鏡
  1、如果需要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu),例如細胞器的改變,則應選擇透射電鏡觀察  

       2、如果需要研究樣品表面的形態(tài)結(jié)構(gòu),如細胞的外形、細胞的生長形態(tài)等,則應選擇掃描電鏡觀察

生物樣品取材、固定、保存

  1、透射電鏡樣品: 

1) “快速”:指盡量在活體條件下取材或動物斷血后2分鐘內(nèi)取材,并迅速將組織放入電鏡專用3.5%戊二醛固定液內(nèi)(不可用酒精或消毒級戊二醛固定),并于4℃冰箱內(nèi)保存,切忌樣品結(jié)冰?!?/p>

2) “準確”:指取材部位要準確。取材的器械要鋒利,盡量減少對組織的牽拉和擠壓。 

3) “體積小、低溫”:指組織厚度不應大于3mm,取材溫度最好控制在4℃左右進行操作。

  2、掃描電鏡樣品

1) 取材時還應盡量保護觀察面,避免用鑷子夾持觀察區(qū)域,在固定前,通常應用適當?shù)那逑匆呵逑礃悠繁砻娴碾s質(zhì),灰塵,粘液等附著物。

2) 常用的清洗波有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液或含酶的清洗液。

3) 樣品取好后,放入3.5%戊二醛固定液內(nèi)固定,保存在4℃冰箱中,切忌樣品結(jié)冰。

流程

  1、透射電鏡

取樣——3.5%戊二醛前固定;1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐級梯度脫水——Epon-618滲透、包理——半薄切片——光鏡選區(qū)定位——修塊——超薄切片機切片——檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色——透射電鏡觀察——攝片——分析+報告

  2、掃描電鏡樣品

1) 取材——清洗——固定——冷凍——SEM觀察(冷凍電鏡)

2) 取材——清洗——固定——脫水——干燥——鍍膜——SEM觀察(常規(guī)檢測)

3) 取材——清洗——固定——組織導電處理——脫水——SEM觀察(特殊樣品,例如外泌體)

花粉烘干噴金二次電子觀察
 

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